抗體治療方式被認為是目前最為流行的重組蛋白治療方式。抗體可以在細胞培養液中以可溶和較為穩定地形式被高水平地表達。使用哺乳動物細胞表達均一的人源化抗體已經被廣泛應用，而細胞的去除和發酵液澄清對于后續工藝的開發具有非常重要的意義。

典型的發酵液澄清工藝

      哺乳動物的培養細胞很容易受到剪切力的影響，容易破碎從而釋放出蛋白酶和其他的宿主細胞蛋白，從而影響抗體的穩定性和純度。此外，由于細胞培養基營養豐富，很容易染菌，從而造成蛋白和工藝設施的污染，所以處理時間對于細胞的去除和澄清也非常重要。離心和切向流過濾常被應用于工業中去除細胞，最近幾年深層過濾的應用也越來越廣泛。絮凝劑有時也被用來增強細胞去除和離心的效果。除菌過濾一般用作色譜柱之前細胞去除和澄清的最后一步。當前細胞去除和發酵液澄清的主要工藝結構如圖1所示。

圖1 大規模動物細胞發酵液的常見澄清工藝

第一級深層過濾，第二級深層過濾、除菌過濾

離心

      工業上大多應用蝶式離心去除細胞及其碎片。蝶式離心可以連續離心，提高處理量，縮短處理時間。圖2為蝶式離心機的結構。

      在離心工藝開發過程中，有很多參數需要優化，如補料的速度、離心機轉速、濾餅層的去除頻率等，這些參數會影響到細胞的穩定性、處理的時間以及抗體收率等。可用通過優化這些參數合理地使各種訴求達到平衡。

圖2 蝶式離心機結構

(1)進料，(2)排出口（輕相），(3)向心泵，(4)碟片，(5)儲渣空間，(6)排渣口，(7)排渣活塞閥，(8)離心捕集器，(9)排出口（重相），(10)噴嘴，(11)計量注水/開啟水，(12)定時器.

切向流過濾

      切向流過濾也和離心一樣被廣泛應用于細胞上清的收集。切向流過濾的優勢在于一步就可以得到無顆粒的細胞上清，不需要額外的過濾步驟。但是在濾膜表面形成的濃縮極化層會嚴重影響膜的處理量，成為切向流過濾的一個主要問題。此外，由顆粒引起的不可逆的膜堵塞會降低膜的使用壽命，成為另一個主要的問題。目前有很多關于削弱濃縮極化層的研究，比如利用轉動膜板來增大膜表面附近的流速，從而將濃縮極化層洗掉，還有一種方法是利用周期性地反沖洗來洗掉極化層。

      對于切向流過濾系統而言，通量和收率是兩個必須要考慮的重要因素。通量決定著處理細胞發酵液所需要的膜面積，具有重要的經濟意義。通量過高會加快膜的堵塞，降低膜的壽命，所以通量的優化非常重要。膜的化學性質和孔徑對于通量和可清洗能力也具有非常重要的決定性作用。此外，膜的載量即單位膜面積所處理的發酵液體積也是一個很重要的參數，需要深入優化，膜的載量優化對工藝的放大具有非常重要的意義。

深層過濾

      深層過濾指的是利用多孔介質從流動相中截留固體顆粒而不是表面截留，且一般介質表面都帶有正電荷，可以通過靜電吸附的方式來攔截雜質顆粒。原理如圖 3 所示。當流體中顆粒較多時往往使用深層過濾。深層過濾介質一般由纖維素或聚丙烯纖維柱床、過濾介質（如硅藻土）和粘合劑（用于制作平整的界面）組成。由于離心不能完全去除細胞及其碎片，而切向流成本太高，所以深層過濾通常被用于離心之后，也可以單獨用于細胞發酵液的澄清。由于深層過濾介質的孔徑并不均一，所以在深層過濾之后會緊接一個除菌過濾工藝，以利于色譜柱的純化。

圖3 深層過濾介質的過濾機理

      深層過濾工藝的開發首先需要選擇過濾介質，介質的化學性質、孔徑、荷電性質是需要重點考慮的因素。在選擇介質的過程中，濾出液的濁度和過濾后介質壓力差的升高將作為兩個重要的參數。另外一個選擇介質的重要參數則是深層過濾之后再用除菌過濾的壓力差變化。

圖4 適用于不同規模的一體式深層過濾

      對于細胞發酵液的澄清工藝，推薦的方案分別為單級深層過濾和雙級深層過濾兩種模式，可完全取代離心步驟，濾出液濁度小于10NTU，通量一般在100L以上。具體選型方案如下圖5所示。

圖5 細胞發酵液澄清工藝

      此外，還有對DNA或HCP等去除特定需求的澄清工藝。

絮凝作用

      絮凝作用通過多種途徑是發酵液中的小顆粒變為大顆粒從而增強后續的過濾效果。絮凝劑通過吸附小顆粒形成大顆粒，減少了堵塞膜孔的小顆粒，同時降低了顆粒的可壓縮性，從而減小了濾餅層的過濾阻力。常用的絮凝劑有硅藻土和珍珠巖。但是向發酵液中加入這些土質的材料，對于原核表達的產品可能沒有問題，但是對于干凈的真核發酵液來說，可能有應用局限性。所以用深層過濾的方式固定這些材料常被用來澄清發酵液。

總結

      合適的細胞去除和澄清的工藝單元取決于生產規模以及工藝設施。大規模工藝的發展使得細胞去除和澄清工藝中蛋白的收率達到98%以上。目前，離心已經成為廣受青睞的細胞去除方式（大于2000L的規模），蝶式離心容易清潔而且比很多大型的切向流裝置容易做無菌處理。但離心裝置的使用必然會需要發酵液的二次澄清過程，另外，需要提供相關的驗證資料，維護成本也相對較高。深層過濾由于其工藝更容易放大，成本更低，處理周期短，且一次性深層過濾工藝由于其操作更加靈活、簡便，現以被越來越多地生物制藥客戶所接受。