由于具有靶向明確、副作用小等優勢，抗體藥物近年來發展迅速。放眼國內，一方面國家通過“新藥創新”科技重大專項為生物醫藥產業發展提供強有力的科技支撐，另一方面越來越多的抗體藥物面臨專利到期，在國內也形成了抗體藥物的開發熱潮。

眾所周知，工程細胞株構建、動物細胞大規模培養工藝及抗體質量分析成為制約我國抗體藥物產業化的主要瓶頸。其中細胞株構建包括宿主細胞改造、載體的構建與轉染、高表達細胞株的篩選等，培養工藝包括培養基開發、培養工藝優化及反應器放大等，抗體質量分析包括影響藥物的特性的表征，如糖基化、純度生物學活性等。

反應器放大作為大規模細胞培養的關鍵環節，對抗體的產量和質量影響十分顯著，然而目前國內企業的抗體開發大多處于申報階段，面臨著規?；a的問題。

1  細胞培養反應器介紹

1.1  反應器種類

抗體藥物生產，主要采用通氣攪拌式生物反應器。根據材質可以分為不銹鋼反應器和一次性反應器。

1.1.1  不銹鋼反應器    迄今為止，FDA批準的抗體藥物基本都是在不銹鋼反應器內完成生產的。不銹鋼反應器通常涉及CIP模塊、SIP模塊、存儲模塊等，自動化程度較高，但面臨著高昂的前期設備投入以及運行成本，著名反應器制造商主要有Applikon公司、ABEC公司等。

1.1.2   一次性反應器   近年來，一次性反應器憑借其免清洗滅菌、免驗證、切換靈活、周期短等優勢迅速占領國內外市場，但是面臨著溶出物風險，自動化程度低。主要制造商有Sartorius公司、GE公司、Thermo公司等。

1.2  反應器放大原則

動物細胞對于培養微環境的改變非常敏感，因此在反應器放大過程中經常會遇到挑戰。就反應器放大工藝來說可以分為兩類：體積依賴性參數和體積非依賴性參數。其中，體積依賴性參數包括攪拌轉速、通氣量、培養體積和流加培養體積等；體積非依賴性參數包括T、pH、DO等。反應器放大的基本策略是保持體積非依賴性參數不變，同時適當地放大體積依賴性參數。然而，對于體積非依賴性參數，往往是非線性放大，因此在實際應用過程中常常采用經驗性放大準則。

體積非依賴性參數放大基本可以分為三類：攪拌相關（氧氣傳質系數、混合時間、P/V、葉尖速率和雷諾數）、通氣相關（氣體體積流速、表觀通氣速率）、幾何尺寸相關；由于基于幾何尺寸的放大原則僅僅考慮反應器的外形尺寸相似，而忽略了反應器內部的傳質和混合，因此實際應用中很少使用，對于攪拌和通氣相關參數而言，很難保證所有參數在放大過程中都保持不變，必須針對具體細胞株以及培養基特性，尋找培養工藝中最敏感因素，從而保證工藝放大一致性。

2  反應器放大存在的問題及對策

攪拌和通氣，作為關鍵的體積依賴性參數，已經成為細胞培養工藝放大公認的難題。一方面攪拌可以促進培養基和O2等營養物的混合，同時增強氣液傳質效果；另一方面，通氣可以滿足細胞生長和抗體合成的O2需求，還可以排除培養基中的CO2。然而，無論是過高的攪拌速度，還是過大的通氣量，都會產生剪切力對細胞生長產生負面影響。由此可見，剪切力、O2供給、CO2排除、pH控制等問題都與攪拌和通氣有關。

2.1  剪切力

反應器內細胞培養的剪切力來源主要分為兩類：攪拌相關和通氣相關。

2.1.1  攪拌相關剪切力   攪拌相關的剪切力主要是指由攪拌槳運動產生的流體剪切力，該剪切力會造成細胞死亡，非致命的生理反應、抗體糖基化水平降低等影響。試驗表明，當反應器內平均能耗散率達到105-106W/kg時，會造成細胞死亡；當反應器內平均能耗散率達到1-100W/kg時，會造成細胞非致命生理反應。而通常情況下，反應器內平均能量耗散率只有0.01-0.15W/kg，因此，正常情況下，流體剪切對細胞的影響較低。

2.1.2  通氣相關剪切力   通氣氣泡對細胞造成的損傷分為四個階段：①氣體分布器處氣泡形成、②攪拌槳打碎氣泡、③培養基內氣泡上升、④氣液交界面氣泡破裂。研究表明，氣液交界面氣泡破碎是導致細胞損傷的主要剪切力來源，結果顯示一個2mm的氣泡破裂可以導致約1000個細胞死亡。除此以外，采用不同孔徑氣體分布器、分布器和攪拌槳的相對位置發現，與大氣泡相比，小氣泡對細胞的損傷更大。

2.1.3  降低剪切力損傷   與攪拌相關的剪切力可以通過降低轉速、改變槳葉形式（翼型槳、象耳槳、斜葉將等）來實現，但是改變轉速或者槳葉形式會影響傳質傳熱混合效果，放大過程需特別注意。與通氣相關的剪切力，則可以通過添加剪切保護劑的方式降低剪切力，如Pluronic F68等，但需注意濃度選擇。

2.2  O2供給

O2是細胞培養的重要營養物質，通常30%的溶氧水平就能滿足大多數細胞生長。對于大規模生產，細胞培養對O2的消耗速率很快，需要通過氣體分布器來加強氣液傳質混合，常見的有：微泡分布器（微米級）和大泡分布器（毫米級），前者通過增加氣泡的表面積來提高氧氣傳質系數（KLa），但是會在氣液交界面形成一層厚厚的氣泡層。后者則會需要較大的通氣量，常用來通入空氣排除培養基內CO2。

隨著反應器體積增加，混合時間明顯增加，反應器內溶氧水平呈現梯度化分布。通過溶氧水平的振蕩性改變來模擬大規模培養過程中可能存在的溶氧梯度化分布。結果表明，振蕩性改變溶氧水平會明顯降低細胞生長速率、最高細胞密度以及細胞活力。

2.3   CO2排除

CO2排除是反應器放大的另外一個難題。由于動物細胞的呼吸熵約為1，即細胞每消耗一分子O2便產生一分子CO2，同時培養基中CO2的溶解度遠高于O2，使得反應器內CO2可以短時間內大量積累。當反應器內CO2濃度達到15-20%時，就會對細胞產生毒害作用，也會對糖基化產生影響。因此，細胞培養基中常用NaHCO3作為緩沖體系。研究表明，發現增大深層通氣量或者使用大泡分布器可以顯著降低CO2，而改變攪拌轉速或表層通氣對降低CO2影響很小。

 

2.4  PH控制

PH作為一個重要工藝控制參數，直接影響細胞正常生長以及抗體糖基化水平。細胞培養過程中產生的乳酸和CO2會使得PH迅速下降，因而需要通過補堿（如NaHCO3等）進行控制PH。隨著反應器放大，混合時間也逐漸增加，堿液的補加也會造成局部PH過高，進而導致細胞裂解。因此，大規模生產堿液補加位置的選擇非常重要，同時選擇低濃度堿液補加。此外，可以采用NaCO3代替NaHCO3，不僅可以降低滲透壓的增加，還可以顯著降低CO2。

2.5  補料培養基流加

培養基的流加應該注意位置和濃度。流加培養基的濃度通常較高，短時間內會造成局部營養物質過剩，進而對細胞代謝狀態產生影響。

3  結語

隨著細胞株構建技術及培養基開發技術的迅速發展，使得細胞密度和抗體產量大幅度提高，對大規模細胞培養提出了嚴峻的挑戰。由于反應器放大的主要依據仍存在一些爭議，例如經驗性、葉尖速率、單位體積攪拌功率、單位體積空氣流量、Kla等放大原則的適宜性等。需深入探討反應器內部剪切力對細胞培養的影響機制，同時借助計算機流體力學技術模擬反應器內部流場分布及混合效果，使反應器放大工藝更加有理論科學依據；同時需要考慮細胞株、培養工藝、反應器個性差異，每個項目的具體限制因素不同，總結出最合適的反應器放大策略。